Base estrutural para inibição da polimerase RNA SARS-CoV-2 por SURAMINA




Artigos https://doi.org/10.1038/s41594-021-00570-0 1



Base estrutural para inibição da polimerase RNA SARS-CoV-2 por SURAMINA





Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) causou uma pandemia global da doença coronavírus 2019 (COVID-19), com mais de 84,66 milhões de infecções e 1,83 milhão de mortes relatadas em 3 de janeiro de 2021 (árbitros 1, 1, 1º de janeiro de 2021).2 ). SARS-CoV-2 é um vírus RNA de sentido positivo e de uma única cadeia. SARS-CoV-2 e vários beta-coronavírus relacionados, incluindo SARS-CoV e síndrome respiratória do Oriente Médio coronavírus (MERS-CoV), são altamente patogênicos. Infecções podem levar a síndrome respiratória aguda grave, perda da função pulmonar e, em casos graves, morte. Comparado ao SARS...CoV e MERS-CoV, SARS-CoV-2 tem maior capacidade de infecções humanos para humanos, o que resultou no rápido crescimento da pandemia3 . Encontrar um tratamento eficaz para o COVID-19, potencialmente também através da redefinição de medicamentos, é uma necessidade médica urgente, mas não atendida. Suina (Fig. 1a) é uma droga centenária que tem sido usada para tratar a doença do sono africana e a cegueira do rio4,5 . Também tem se mostrado eficaz em inibir a replicação de uma ampla gama de vírus, incluindo enterovírus6 , Zika vírus7, Chikungunya8 e Ebola vírus9 . Os mecanismos de inibição viral da suramina são diversos, incluindo inibição de apego viral, entrada viral e liberação de células hospedeiras em parte através de interações com proteínas capsidas virais7,8,10,11. Recentemente, a suramina tem sido demonstrada para inibir a infecção pelo SARS-CoV-2 na cultura celular, impedindo a entrada celular do vírus12. Aqui relatamos que a suramina também é um potente inibidor da polimerase RNA dependente de SARS-CoV-2 RNA (RdRp), enzima essencial para o ciclo de vida viral. A potência da suramina em bioquímicos RdRp ensaios de inibição é pelo menos 20 vezes mais potente do que remdesivir, o atual medicamento nucleotídeo aprovado pela Food and Drug Administration para o tratamento do COVID-19. A atividade de suramina na inibição viral baseada em células é semelhante à remdesivir porque a carga altamente negativa da suramina impede uma absorção celular eficiente. Uma estrutura de microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revela que a suramina se liga ao RdRp site ativo, bloqueando a vinculação tanto do modelo RNA quanto dos fios de primer. Esses resultados fornecem um modelo estrutural para o design de derivados de suramina de próxima geração como SARS-CoV-2 RdRp Inibidores. Inibição de Resultados de RdRp e anti-SARS-CoV-2 por suramina. A polimerase RNA central do SARS-CoV-2 é composta de proteína não estrutural nsp12 com duas subunidades de acesso nsp7 e nsp8 (refs. 13,14). Incubação do complexo nsp12-7-8 purificado (Estendido Data Figs. 1a,b) com um modelo de 30 bases e primer de 20 bases (poly-U em Fig. 1b) permitiram extensão de primer ao mesmo comprimento que o modelo na presença de concentrações saturadas de ATP como ilustrado em um ensaio baseado em gel (pista 1 em Fig. 1c). A adição de 8-32 μM suramin quase aboliu o alongamento da cadeia de primer enquanto exigia 100-1.000 μM de remdesivir em sua forma de triphosfato (RDV-TP) para alcançar o mesmo grau de inibição sob as mesmas condições15. A adição de 100 μM suina bloqueou completamente a formação de RdRp–Complexo de RNA, enquanto exigia mais de 5mM de RDV-TP para inibir a vinculação de RdRp para RNA (Fig. 1d e Fig. Dados Estendidos 1c). Ensaios baseados em soluções de RdRp a inibição determinou que a concentração de inibição semi-máxima (IC50) da suramina é de 0,26 μM (Fig. 1e), e o IC50 para RDV-TP é de 6,21μM em condições de ensaio idênticas (Dados Estendidos Fig. 1d), sugerindo que a suramina é pelo menos 20 vezes mais potente que a RDV-TP. Experimentos baseados em células indicaram que a suramina foi capaz de inibir a base estrutural SARS-CoV-2 para a inibição da polimerase sars-cov-2 RNA por suramina Wanchao Yin 1,9, Xiaodong Luan  2,3,4,9, Zhihai Li 1.5,9, Rio Ziwei Zhou1,5,6,9, Qingxing Wang 6,7,9, Minqi Gao8, Xiaoxi Wang1, Rio Fulai Zhou1, Jingjing Shi1, Erli Você1, Mingliang Liu1, Qingxia Wang1.5, Yi Jiang 1.6, Hualiang Jiang 1,6, Gengfu Xiao7, Leike Zhang 6,7 ✉, Xuekui Yu 1,5,6 ✉, Shuyang Zhang 2,3,4 ✉ e H. Eric Xu 1,6 ✉ A pandemia COVID-19 causada por infecções ininterruptas do SARS-CoV-2 continuou a devastar muitos países em todo o mundo. Aqui relatamos que a suramina, uma droga de 100 anos, é um potente inibidor da polimerase RNA dependente de RNA sars-CoV-2 (RdRp) e age bloqueando a vinculação do RNA à enzima. Em ensaios bioquímicos, a suramina e seus derivados são pelo menos 20 vezes mais potentes do que remdesivir, o medicamento nucleotídeo atualmente aprovado para tratamento de COVID-19. A estrutura de microscopia crio-elétron de 2,6 Å do viral RdRp ligado à suramina revela dois locais de ligação. Um site bloqueia diretamente a vinculação do fio do modelo RNA e o outro site entra em conflito com o fio de primer RNA perto do RdRp sítio catalítico, inibindo assim RdRp atividade. A suina bloqueia a replicação viral nas células Vero E6, embora as razões subjacentes a esse efeito sejam provavelmente várias. Nossos resultados fornecem um mecanismo estrutural para um nãonucleotídeo inibidor do SARS-CoV-2 RdRp. Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 319 Artigos Nature Structural & Molecular Biology duplicação em células Vero E6 com uma concentração efetiva semi-máxima (EC50) de aproximadamente 2,9 μM, que é aproximadamente a mesma faixa que remdesivir no mesmo ensaio (Fig. 1f e Fig. Dados Estendidos Fig. 1e)16. A aparente inibição mais fraca da suramina em ensaios baseados em células do que em ensaios de inibição de enzimas pode ser devido à carga altamente negativa de suramina que impede sua absorção eficiente pelas células hospedeiras. O CC50 (concentrações de medicamentos necessários para reduzir a viabilidade celular em 50%) de suramina é mais de 1.000 μM, indicando que sua citotoxicidade relativamente baixa que é menor do que a de remdesivir (Fig. 1f e Fig. Dados Estendidos 1e). A estrutura do RdRpComplexo de suramina. Para os estudos crio-EM, incubamos o SARS-CoV-2 RdRp complexo com excesso molar de dez vezes de suramina (Métodos). A estrutura foi determinada em uma resolução global de 2.57Å com 95.845 partículas de mais de 8 milhões de partículas originais auto-escolhido de 11.846 micrografos (Dados Estendidos Fig. 2 e Tabela 1). O mapa EM revela densidade clara para todos os componentes-chave do RdRp–complexo de suramina, incluindo um nsp12 (resíduos S6-C22, V31-I106, M110-L895 e N911-T929), um nsp7 (resíduos K2-G64), dois nsp8 (resíduos D78-A191 para nsp8-1 e resíduos T84-A191 para nsp8-2, respectivamente) e duas moléculas de suramina (Fig. 2a e Dados Estendidos Fig. 3). A estrutura geral do RdRp–complexo de suramina é muito semelhante ao apo-RdRp complexo, com uma raiz média de desvio quadrado (r.m.s.d.) de 0,465Å para todos os Cα átomos entre as duas estruturas (Fig. 2b e Fig. dados estendidos 4a). O núcleo RdRp estrutura complexa também é muito semelhante a o núcleo recentemente resolvido RdRp complexo com nsp13 e nsp9 ou nsp13 (refs. 17-19) (Dados Estendidos Fig. 4b-d). Nsp12 adota a mesma configuração de dedos de palma da mão direita, com seu local ativo catalítico composto por sete motivos altamente conservados 0.1 1 10 100 1.000 0 50 100 150 0 50 100 150 Porcentagem de inibição Percentual de viabilidade celular CC50 > 1.000 μM EC50 = 2,93 ± 0,28 μM RNA livre RdRp–Complexo RNA 1 10 1.000 5.000 RNA apenas 0 nsp12-nsp7-nsp8 complexo (9 μg) + poly-U (1 μg) 100 1 23456 7 1 2 8 16 RNA apenas 0 32 Poly-U + 10 mM ATP 4 EP P 12345678 Suramin Suino (μM) Suramina (μM) Suramina (μM) Suramina (μM) 5'FAM 3 - ′ 3′ 5′ Poly-U: a c b d e f 0,0001 0,001 0,01 0,1 10 0 50 100 150 razão de inibição (%) IC50 = 0,26 ± 0,03 μM N H S O O O S – O O – O S O O – O O HN O N H N H O O NH O O – O O S O – O O – S O O O S N H 8 7 6 5 4 3 1 2 8 7 6 5 4 3 2 1 A B C D A' B' C' D' Fig. 1 | Inibição de RdRp pela suramina e o potencial efeito anti-SARS-CoV-2 da suramina. a, a estrutura química da suramina. b, O modelo de 30 bases e 20 bases primer duplex RNA com FAM (Carboxyfluoresceína), aos 5′ da cartilha. Poly-U foi usado no ensaio de alongamento à base de gel para SARS-CoV-2 RdRp. c, ensaios de gel de alongamento de RNA duplex parcial pelo purificado RdRp complexo e sua inibição por suramina. EP, produto alongado; P, primer RNA strand. d, Mudança de mobilidade gel do RdRp–Complexo de RNA e o efeito da suramina. e, IC50 de suramin para RdRp complexo, determinado por dois experimentos independentes e barras de erro são a média ± S.D. dos dados. f, EC50 de suramina para inibição SARS-CoV-2 e CC50 de suramina para toxicidade baseada em células, determinada por três experimentos independentes e barras de erro são a média ± S.D. dos dados. Imagens não ressarcidas para c e d e dados para os gráficos em e e f estão disponíveis como dados de origem on-line. Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 320 Artigos de Estrutura e Biologia Molecular da Natureza a b Palm Rio NiRAN Interface nsp7 nsp8-1 Suramin nsp8-2 Suramin no. 1 180° 180° β-hairpin Fingers Thumb Palm Rio NiRAN Interface nsp7 nsp8-1 Suramin nsp8-2 Suramin no. 1 β-hairpin Fingers Thumb Suramin no. 2 Suramin no. 1 Thumb Palm Rio NiRAN Interface nsp7 nsp8-1 nsp8-2 β-hairpin Fingers Palm Rio NiRAN Interface nsp7 nsp8-1 sombrio nsp8-2 o. 1 β-hairpin Thu Thumb Palm Rio NiRAN Interface nsp7 nsp8-1 nsp8-2 β-grampo de cabelo Dedos Suramin nº 2 Suramin nº 1 Fig. 2 | Estruturas gerais do RdRpComplexo de suramina. a, Duas visões do mapa de densidade crio-EM do RdRpComplexo de suramina. SARS-CoV-2 nsp12 tem uma extensão n-terminal composta pelo β-grampo de cabelo (verde), o Rio NiRAN domínio (amarelo) e um domínio de interface (roxo) adjacente ao RdRp domínio núcleo, que consiste nos seguintes subdomínios: dedos, palma e polegar, violeta colorida, laranja e azul, respectivamente. Nsp12 se liga a um heterodimer de nsp7 (verde claro) e nsp8 (nsp8-2, vermelho) bem como a uma segunda subunidade de nsp8 (nsp8-1, vermelho). As duas moléculas de suramina amarradas são definidas em verde escuro. Este código de cores é usado por toda parte. B Dois vistas da estrutura geral do RdRp–complexo de suramina, o esquema de cores é tão acima. a b G F A B C D E nsp12(1-932) 1 Rio NiRAN 250 Interface 365 RNA dependente de RNA polimerase 932 Dedos (S397-A581, K621-G679) Palma (T582-P620, T680-Q815) Polegar (H816-E920) Motivo G: 499-511 Motivo F: 544-560 Motivo A: 612-626 Motivo B: 678-710 Motivo C: 753-767 Motivo D: 771-796 Motivo E: 810-820 Motivo C Motivo D Motivo F Motivo G Motivo A Motivo B Motivo E Sufoco não. 2 180° Suramin no. 1 Motivo C Motivo D Motivo F Motivo G Motivo E Motivo A Suramin nº 1 Suramin nº 2 Motivo B Fig. 3 | Os motivos conservados A-G no RdRpComplexo de suramina. a, diagrama esquemático do RdRp subunidade complexa nsp12; motivos A a G são destacados. b, Interações das duas moléculas de suramina com motivos A-G de RdRp. O código de cor é o seguinte: motivo A (ciano), motivo B (ouro), motivo C (vermelho laranja), motivo D (vermelho violeta médio), motivo E (magenta), motivo F (azul) e motivo G (verde). Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 321 Artigos Nature Structural & Molecular Biology A-G (Fig. 3a). Duas moléculas de suramina se encaixam na câmara catalítica (Figs. 2a,b e 3b). As interações de suramina com SARS-CoV-2 RdRp. Uma molécula de suramina (suramin nº 1) é encaixada em uma cavidade formada por um motivo conservado G e o n terminus de motivo B (Figs. 3b e 4a). A estrutura química da suramina tem uma simetria dupla com um linker de ureia no centro (Fig. 1a). O mapa de densidade EM para suramina nº 1 é claramente definido, mas apenas para metade da molécula de suramina sem o linker de ureia (Fig. 4a,b). As principais interações do suramin nº 1 com RdRp foram resumidos na Fig. 4c e na Tabela Suplementar 1, incluindo ligações de hidrogênio, interações de carga e interações hidrofóbicas de embalagem com conservadas RdRp resíduos, que contêm a naftalina-trisulfônico cabeça de ácido em uma cavidade relativa estreita. Dois dos três sulfonatos (posições 3 e 5) formam ligações de hidrogênio com as cadeias laterais de N497, K500, R569 e Q573, e a cadeia principal de N497, enquanto o sulfonato na posição 1 aponta para o solvente e forma apenas uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de N496. A cadeia lateral K577 forma a cadeia de formação-π empilhamento com o anel de naftalina, e também forma uma ligação de hidrogênio com o linker de ligação de amida entre os anéis de naftalina e benzeno. O linker de ligação entre os anéis de benzeno C e D forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia principal NH de G590. Além disso, a suramina nº 1 está em contato van der Waals com vários resíduos, incluindo L576, A580, A685, Y689 e L758. A segunda molécula de suramina (suramin nº 2) é encaixada na cavidade perto do local ativo catalítico formado pelos motivos conservados A, C, E e F (Figs. 3b e 4b). Novamente, apenas metade da molécula foi observada na estrutura com mapa de densidade EM claro. As principais interações do suramin nº 2 com RdRp são resumidos na Fig. 4d e tabela suplementar 1, incluindo ligações de hidrogênio, interações de carga e interações hidrofóbicas de embalagem. Diferente da suramina nº 1, o sulfonato na posição 5 da suramina nº 2 aponta para o solvente e forma apenas uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de R555, enquanto os outros dois sulfotos nas posições 1 e 3 formam ligações de hidrogênio com as cadeias laterais de K551, R553, R555 e R836, e as cadeias principais de A550 e K551. Enquanto isso, a cadeia lateral de R555 também forma uma ligação de hidrogênio com o linker de ligação de amida entre os anéis de naftalina e benzeno. A cadeia lateral R836 forma a cadeia de formação-π empilhamento com o anel de benzeno C. O NH do anel de benzeno D forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de D865. Além disso, a suramina nº 2 está em contato van der Waals com vários resíduos, incluindo H439, I548, S549, A840, S861 e L862. Alinhamento de sequência com RdRp de vários coronavírus indicou que esses resíduos de contato com suramina são conservados (Fig. 1 Suplementar), sugerindo que a suramina pode ser um inibidor geral da viral RdRp. Mecanismo de inibição da suramina em direção ao SARS-CoV-2 RdRp. Comparação estrutural do RdRp–complexo suramin com o remdesivir-vinculado RdRp complexo revela o mecanismo de RdRp inibição por suramina (Fig. 5a). Se a posição base de remdesivir foi definida como uma posição +1, então a primeira molécula de suramina ocupa o espaço de −1 a −3 posições do modelo RNA a b d c Finger Palm R569 Q573 K 577 N497 G590 Y689 A580 N496 K500 L758 L576 A685 Suramin no. 2 Suramin nº 1 Suramin nº 1 Polegar de Dedo 90° S549 R555 I548 R836 L862 D865 R553 A840 S861 H439 R551 R553 A550 R836 D865 A840 L862 Suramin no. S861 H439 Fig. 4 | Visões próximas das interações entre o SARS-CoV-2 RdRp e suramina. a,b, mapas EM para as duas moléculas de suramina: nº 1 (a) e nº 2 (b). c,d, Interações das duas moléculas de suramina com RdRp: nº 1 (c) e nº 2 (d). A ligação de hidrogênio é exibida como uma linha azul tracejada. Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 322 Nature Structural & Molecular Biology Articles strand (suramin nº 1 em Fig. 5b). A segunda molécula de suramina no local ativo ocupa o espaço da cadeia de primer que varia de −4 a +1 posições (suramin nº 2 em Fig. 5c). A ligação dessas duas moléculas de suramina bloqueia assim a ligação do modelo RNA-primer duplex ao local ativo, bem como a entrada de triphosfato nucleotídeo no local catallítico, o que resultaria na inibição direta do RdRp atividade catalítica. O mecanismo de inibição direta do SARS-CoV-2 RdRp por suramina é diferente da inibição mediada pela suina do norovírus RdRp, que também continha dois locais de ligação para suramin20. Em cada local, apenas metade da molécula de suramina foi vista. Comparação estrutural do SARS-CoV-2 RdRp com o norovírus RdRp revela que apenas um dos dois locais de ligação suramin (suramin nº 2) parcialmente sobreposto (Dados Estendidos Fig. 5a,c,d). Os sites de ligação de suramina no norovírus RdRp não colidir com os fios de RNA, mas um dos locais de ligação suramin sobreposto com o canal de entrada nucleotídeo proposto, bloqueando indiretamente RdRp atividade de polimerização. Este mecanismo é diferente do bloco direto da vinculação do modelo RNA ao SARS-CoV-2 RdRp por suramin (Fig. 5). Além disso, comparações estruturais do SARS-CoV-2 RdRp–estrutura de suramina com as estruturas do norovírus RdRp ligados a derivados de suramina mostram que derivados de suramina e suramina se ligam ao RdRp com diversas conformações e orientações20,21 (Figos de Dados Estendidos.b,e e 6). Inibição SARS-CoV-2 RdRp por derivados de suramina. Os derivados da suino foram explorados para diversas aplicações, incluindo doenças parasitárias e câncer10. Para determinar a relação estrutura-atividade para derivados de suramina, examinamos um conjunto de diferentes usando in vitro RdRp ensaios de extensão de primer (Fig. 6a e Extended Data Fig. 1f). Todos os oito derivados de suramina testados mostraram inibição eficiente de RdRp atividade (Dados Estendidos Fig. 1g). NF157, NF279 e NF449 são os inibidores mais potentes com IC50 de 0,05 μM, cerca de cinco vezes mais potente que a droga-mãe (Fig. 6b). Ensaios baseados em células mostraram que nF110 inibiu a replicação SARS-CoV-2 com um EC50 de 2,87 μM (Fig. 6c), enquanto NF157 e NF279 inibiram a replicação SARS-CoV-2 com EC50 de aproximadamente 10μM. Os valores CC50 de todos os derivados de suramina são superiores a 1.000μM, indicando uma boa janela de segurança. No entanto, há uma separação de 200 vezes entre sua potência bioquímica em inibir RdRp atividade e sua potência em inibir a replicação viral em ensaios baseados em células. Isso é provavelmente devido às dificuldades desses derivados de suramina a serem tomados por células hospedeiras22. A formulação futura de medicamentos, por exemplo, com nanopartículas à base de quitosan glicol23, pode melhorar sua biodisponibilidade aos tecidos pulmonares e sua potência em inibir a replicação viral. Discussão A atual pandemia COVID-19 evidencia a necessidade de vacinas eficazes e tratamentos medicamentosos para a doença. A suina tem sido usada para tratar a doença do sono africana e que também tem mostrado atividade contra uma série de vírus em estudos pré-clínicos. Além disso, a suramina foi mostrada para bloquear SARS-CoV-2 em uma etapa anterior do ciclo de replicação em ensaios de tempo de adição12. Aqui, demonstramos que a suramina é um inibidor direto e potente do SARS-CoV-2 RdRp, a b c Palm Fingers Thumb Suramin nº 2 Suramin no. 1 Template Primer Palm Fingers Thumb RMP 90° RdRp complexo (ligado à suâmia) RdRp complexo ( complexo (remdesivir bound) Modelo de primer R569 Q573 K577 N497 G590 I589 Y689 A580 N496 K500 I494 L758 L576 A685 –3 –2 –1 D684 Modelo R553 S549 A550 R555 I548 S861 R836 D865 L862 R858 K849 C813 S814 Q815 S759 D760 –1 –2 –3 –4 RMP Suramin no. 1 Suramin no. 2 Fig. 5 | Mecanismo de inibição a partir da comparação com o remdesivir-vinculado RdRp estrutura. a, Pontos de vista gerais do RdRp–complexo suramin sobreposto com o remdesivir-vinculado RdRp estrutura (PDB ID 7BV2). Para clareza, apenas os domínios de polimerase são apresentados. o remdesivir-vinculado RdRp estrutura é mostrado em cinza claro, o modelo RNA é ciano e o primer RNA é laranja. b, Visão de perto da suramina nº 1 sobreposta com fio modelo RNA do remdesivir-vinculado RdRp estrutura. c, Visão de perto da suramina nº 2 sobreposta com o fio primer RNA do remdesivir-vinculado RdRp estrutura. natureza estrutural & Molecular biologia | VOL 28 | Março | 2021 319-325 | www.nature.com/nsmb 323 Artigos natureza estrutural & Molecular biologia NF023 NF110 NF157 NF279 NF449 NF546 c b a 0.1 10 100 1.000 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade 0,01 0.1 1 10 100 1.000 EC50 = 34,10 ± 3,14 μM CC50 > 1.000 μM EC50 = 2,87 ± 0,36 μM CC50 > 1,1,0 000 μM EC50 = 9,52 ± 1,76 μM CC50 > 1.000 μM EC50 = 9,25 ± 0,62 μM CC50 > 1.000 μM EC50 = 12,99 ± 0,71 μM CC50 > 1.000 μM EC50 = 27,40 ± 6,20 μM CC50 > 1.000 μM 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 0 50 100 150 NF023 (μM) 0,0001 0,001 0,01 0.1 10 NF279 (μM) NF023 (μM) 0,1 10 100 1.000 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade NF279 (μM) 0.1 10 100 1.000 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade NF449 (μM) 0.1 10 100 1.000 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade NF546 (μM) NF110 (μM) 0 50 100 150 0 50 100 150 porcentagem inibição porcentagem célula viabilidade 0.1 1 10 100 1.000 NF157 (μM) 0,0001 0.001 0.01 0.1 1 10 NF110 (μM) inibição relação (%) 0 50 100 150 inibição relação (%) 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 NF449 (μM) 0 50 100 150 inibição relação (%) 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 NF546 (μM) 0 50 100 150 inibição relação (%) 0 50 100 150 inibição relação (%) 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 NF157 (μM) 0 50 100 150 inibição relação (%) IC50 = 0,14 ± 0,01 μM IC50 = 0,55 ± 0,005 μM IC50 = 0,41± 0,001 μM IC50 = 1 .13 ± 0,12 μM IC50 = 0,58 ± 0,04 μM IC50 = 0,041 ± 0,005 μM N H O N H HN O H N O O S O S O O O O S O O S O O O S O O O S O O O S O O S O O O HN N H O H N O O H N O N H NH O O O S O O O S O O N H S O O O S – O O – O S O O – O O F HN O N H N H O O NH F O O – O O S O – O O – S O O O S N H N H S O O O S – O O – O S O – O – – – – – – – – – – O O N H O NH N H O O N H O O – O O S O – – – – – – – – – – – O O – S O O O S N H S O O O O S O O HN N H O H N O N H O S O O O O S O O O O S O O O O S O H N O NH O O S O O O O S N H OH- - - O HN O N H O P O O P O O N H O O P O O P O NH O N H OH ah Eu tenho Eu tenho Fig. 6 | inibição SARS-CoV-2 RdRp por suramin Derivados. um químico Estruturas de suramin Derivados. b, O inibição de RdRp atividade por suramin Derivados, determinado por Dois independente Experiências e erro Bares exibição o significar ± S.D. de o dados. C inibição de viral replicação e celular toxicidade de suramin Derivados, determinado por Três independente Experiências e erro Bares exibição o significar ± S.D. de o dados. Os dados de origem para b e c estão disponíveis online. Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 324 Artigos de Biologia Estrutural e Molecular da Natureza uma enzima essencial para o ciclo de vida viral. A estrutura revela que suramin se liga ao local ativo de RdRp, bloqueando a vinculação de ambos os fios do substrato RNA do modelo-primer e inibindo a atividade de polimerase do RdRp. Derivados de suramina também mostraram potente inibição de RdRp atividade e replicação viral bloqueada em ensaios baseados em células. Juntos, esses resultados revelam o mecanismo estrutural de um nãonucleotídeo inibidor do SARS-CoV-2 RdRp. A estrutura e os resultados bioquímicos apresentados neste artigo fornecem uma lógica para desenvolver análogos de suramina e formulações de medicamentos que melhorem a potência e a eficácia da droga. No entanto, há uma série de limitações de suramina, incluindo sua alta carga negativa, o que dificulta sua entrada eficiente na célula. Além disso, há riscos potenciais de efeitos fora do alvo em polimerases celulares e helicases. No entanto, a suâmia pode servir como um interessante "composto de ferramentas" para estudos mecanicistas fundamentais sobre o viral RdRp, o que poderia, em última análise, ajudar no desenvolvimento de drogas para o COVID-19. Conteúdo on-line Quaisquer métodos, referências adicionais, resumos de relatórios da Nature Research, dados de origem, dados estendidos, informações complementares, reconhecimentos, informações de revisão por pares; detalhes do autor contribuições e interesses concorrentes; e declarações de dados e disponibilidade de código estão disponíveis em https://doi.org/10.1038/ s41594-021-00570-0. Recebido: 28 de outubro de 2020; Aceito: 5 de fevereiro de 2021; Publicado online: 5 março 2021 References 1. Coronaviridae Grupo de Estudos do Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus. também coronavírus grave relacionado à síndrome respiratória aguda: classificando 2019-nCoV e nomeando-o SARS-CoV-2. Nat. Microbiol. 5, 536–544 (2020). 2. Dong, E., Du, H. & Gardner, L. Um painel interativo baseado na Web para rastrear o COVID-19 em tempo real. Lancet Infect. Dis. 20, 533-534 (2020). 3. Sancho, S. et al. Alta contagiosa e rápida disseminação da Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavirus 2. 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Nota da editora Springer Nature permanece neutra em relação às reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais. © O Autor(s), sob licença exclusiva para Springer Nature America, Inc. 2021 Tabela 1 | Estatísticas de coleta, refinamento e validação de dados Crio-EM SARS-CoV-2 RdRp-suramin complex (EMD-30572, PDB 7D4F) Coleta de dados e ampliação de processamento 46.773 Voltage (kV) 300 Exposição eletrônica (e– /Å2 ) 68 Intervalo de defoco (68 Defocus range (μm) −0,5 a −2.0 Tamanho de Pixel (Å) 1.069 Simetria imposta C1 Imagens iniciais de partículas (nº) 8.557.180 Imagens de partículas finais (nº) 95.845 Resolução do mapa (Å) 2.6  Limite FSC 0.143 Faixa de resolução do mapa (Å) 2.5-6.0 Refinamento Modelo inicial usado resolução modelo 7BV1 (Å) 2.7  Limite FSC 0.5 Faixa de resolução do modelo (Å) 28.0-2.7 Fator B de nitidez do mapa (Å2 ) −27.866 Composição do modelo  Átomos não-masdrogênio 9.534  Resíduos proteicos 1.181  Ligantes 4 fatores B (Å2 )  Proteína 63.49  Desvios de ligante 64,64 R.m.s.  Comprimentos de ligação (Oh) 0.012  Ângulos de título (°) 0.904 Validação  MolProbity pontuação 1.34  Clashscore 5.43  Rotadores pobres (%) 0.76 Ramachandran enredo  Favorecido (%) 97.77  Permitido (%) 2.23  Não permitido (%) 0 Nature Structural & Molecular Biology | VOL 28 | março de 2021 | 319-325 | www.nature.com/nsmb 325 Artigos Nature Structural & Molecular Biology Methods Constructs e expressão do complexo RdRp. O complexo Te RdRp foi preparado de acordo com o mesmo método relatado14 como descrito abaixo. Te gene de comprimento total do SARS-CoV-2 nsp12 (encodes resíduos 1-932) foi quimicamente sintetizado com otimização de codon (General Biosystems). Te gene foi clonado em um vetor de expressão de baculovírus pFastBac modificado contendo uma sequência de partida ATG de 5′ e o site de protease do vírus da etch de tabaco terminal C (TEV), seguido por uma tag His8. Te plasmid contém uma methionina adicional no n terminus e GGSENLYFQGHHHHHHHH no cupins C de nsp12. Os genes de comprimento total para nsp7 (encodes resíduos 1-83) e nsp8 (resíduos de codificação 1-198) foram clonados no vetor pFastBac contendo uma sequência inicial ATG de 5′. Todas as construções foram geradas usando o DNA Phanta Max Super-Fidelity Polymerase (Vazyme Biotech) e veríferas pelo sequenciamento de DNA. Todas as construções foram expressas em células Spodoptera frugiperda (Sf9). As culturas celulares foram cultivadas em ESF 921 médio livre de soro (Sistemas de Expressão) para uma densidade de 2-3 milhões de células por ml e, em seguida, infectadas com três baculovírus separados a uma proporção de 1:2:2 para nsp12, nsp7 e nsp8 em uma multiplicidade de infecção de cerca de fve. Foram coletadas 48h de infecção afer a 27 °C e as pelotas celulares foram armazenadas a -80 °C até o uso. Além disso, os genes de nsp7 e nsp8 foram clonados em um vetor pET-32a(+) modificado contendo uma sequência inicial ATG de 5′ e tag C-terminal His8 com um local de decote TEV para expressão em E. coli. Plasmídeos foram transformados em BL21(DE3) (Invitrogen). As culturas bacterianas foram cultivadas para um OD600 de 0,6 a 37 °C, e então a expressão foi induzida com uma concentração final de 0,1mM de isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside e a temperatura de crescimento foi reduzida para 16 °C para 18-20h. As culturas bacterianas foram pelotas e armazenadas a -80 °C até o uso. Purificação do complexo RdRp. A purificação de nsp7 e nsp8 expressas nas bactérias BL21(DE3) foi semelhante à purificação de nsp7 e nsp8 relatada anteriormente14. Resumidamente, as células bacterianas foram lístidas com um homogeneizador de alta pressão operando a 800bar. Os lysates foram limpos por centrifugação a 25.000g por 30min e foram então vinculados às contas Ni-NTA (GE Healthcare). Após a lavagem com tampão contendo imidazol de 50mM, a proteína foi elucidada com tampão contendo imidazol de 300mM. A etiqueta foi removida com incubação de protease TEV durante a noite e amostras de proteínas foram concentradas com unidades de filtro de corte de peso molecular de 3 ou 30kDa (Millipore Corporation) e, em seguida, separada por uma coluna Superdex 75 Increase 10/300 GL em 25mM HEPES pH7.4, 200mM cloreto de sódio, 5% (v/v) glicer de sódio. As frações para o nsp7 ou nsp8 foram coletadas, concentradas em cerca de 10mgml-1 e armazenadas a −80°C até o uso. As células Sf9 contendo o complexo rdrp coexpresso foram resuspended em tampão de ligação de 25mM HEPES pH7.4, 300mM cloreto de sódio, 25mM imidazol, 1mM cloreto de magnésio, 0,1% (v/v) IGEPALCA-630 (Anatrace), 1mM tris (2-carboxyethyl)fosfina (TCEP), 10% (v/v) glicerol com coquetel inibidor de Protease adicional sem EDTA (Bimake) e depois incubado com agitação por 20min a 4 °C. As células incubadas foram lysed com um homogeneizador de alta pressão operando a 500bar. O supernante foi isolado por centrifugação a 30.000g por 30min, seguido pela incubação com contas Ni-NTA (GE Healthcare) por 2h a 4 °C. Após a ligação, as contas foram lavadas com 20 volumes de coluna de tampão de lavagem de 25mM HEPES, cloreto de sódio pH7.4, 300mM de sódio, 25mM imidazol, 1mM cloreto de magnésio, 1mM TCEP e 10% (v/v) glicerol. A proteína foi elucidada com volumes de 3-4 colunas de tampão de elução de 25mM HEPES pH7.4, cloreto de sódio de 300mM, imidazol de 300mM, cloreto de magnésio 1mM, 1mM TCEP e 10% (v/v) glicerol. O complexo de RdRp coexpresso foi incubado com nsp7 e nsp8 adicionais da expressão bacteriana em uma relação molar 1:1:2 e incubado a 4 °C por 4h. O complexo RdRp incubado foi concentrado com uma unidade de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kDa (Millipore Corporation) e, em seguida, separado por um Superdex 200 Aumento de 10/300GL coluna em 25mM HEPES pH7.4, 300mM cloreto de sódio, cloreto de magnésio 1mM e 1m TCEMP. As frações para o complexo monomérico foram coletadas e concentradas em até 12mgml-1 . O sal de sódio suramin (comprado da MedChemExpress) foi dissolvido em água até 50mM. Os derivados de suramina (comprados da TopScience) foram dissolvidos em água em concentrações de 5 a 50mM. Para o complexo ligado à suramina, o complexo concentrado de RdRp em uma concentração de 12mgml-1 foi incubado com suramina de 0,8mM a 4 °C por 0,5h para o próximo passo dos experimentos EM. Preparação de amostras Crio-EM e aquisição de dados. Uma alíquota de 3μl de amostra de proteína do complexo ligado à suramina (12mgml−1 ) contendo 0,0035% DDM foi aplicado em uma grade de malha de 200 ondas de brilho (Quantifoil R1.2/1.3), borrada com papel filtro para 3,0 s e mergulhada em etano líquido usando um FEI Vitrobot Mark IV. Os crio-EM foram coletados em um microscópio Titan Krios de 300 kV (FEI) equipado com um filtro de imagem Gatan (operado com uma largura de fenda de 20 eV) (GIF) e câmera de detecção direta K3. O microscópio foi operado a uma ampliação calibrada de ×46.773, produzindo um tamanho de pixel de 1.069Å em micrografias. No total, 11.846 micrografos no total foram coletados a uma taxa de dose eletrônica de 22,7 e-Å−2 s−1 com uma faixa de desfoco de −0,5μm a −2.0μm. Cada vídeo com uma dose acumulada de 68 e-Å-2 na amostra foi fracionado em uma pilha de vídeo de 36 quadros de imagem. Processamento de imagens. Os quadros em cada pilha de vídeo foram alinhados para correção de movimento induzida pelo feixe usando o programa MotionCorr2 (ref. 24). CTFFIND4 (ref. 25) foi utilizado para determinar os parâmetros da função de transferência de contraste (CTF). Desse ano, foram selecionados 10.241 micrografos para posterior processamento de dados. O programa de auto-colheita do Relion 3.0 (ref. 26) foi usado para colher as partículas com o modelo do complexo apo-RdRp de COVID-19 (PDB ID 7BV1)15 como referência, produzindo um total de 8.557.180 partículas colhidas. Em seguida, a pilha de partículas extraídas foi transferida para o software Cryosparc v.2 (ref. 27) e foi realizada uma rodada de classificação 2D livre de referência. Em seguida, 3.159.808 partículas foram selecionadas a partir de classes que representam projeções do complexo rdrp ligado à suramina em diferentes orientações e foram submetidas a duas rodadas de refinamento heterogênios usando uma reconstrução do complexo apo-RdRp de COVID-19 (EMD-30209)15 como mapa inicial. Uma classe tridimensional (3D) convergente com um recurso de alta resolução contém um nsp12, um nsp7 e duas cópias de nsp8. As partículas dessa classe 3D foram então importadas de volta para Relion 3.0 e submetidas a uma rodada de alinhamento focado com uma máscara, incluindo todos os componentes da proteína. Finalmente, 95.845 partículas de uma classe 3D mostrando o maior recurso de resolução foram selecionadas para uma rodada de refinamento 3D. Após uma rodada de refinamento ctf e polimento bayesiano de partículas, outra rodada de refinamento 3D foi realizada, produzindo uma reconstrução final em uma resolução global de 2,57Å com base na correlação da concha Fourier padrão-ouro (FSC)=0,143 critério28. A resolução local foi calculada com Relion 3.0. Construção modelo. O modelo do complexo RdRp ligado à suramina foi construído acoplando o modelo de estrutura de apo de COVID-19 RdRp (PDB ID 7BV1) no mapa de densidade usando UCSF Quimera29, seguido pela construção do modelo ab initio do domínio NiRAN n-terminal de nsp12 e uma cópia de nsp8 em COOT30, e refinamento espacial real usando real_space_refine programa em PHENIX31. As estatísticas do modelo foram calculadas com MolProbity32 e listadas na Tabela 1. Figuras estruturais foram preparadas em Quimera ou QuimeraX33. Preparação do RNA de modelo-primer para ensaios de polimerase. Para o modelo poli-A-primer RNA, um curto oligonucleotídeo de RNA com sequência de 5'-FAMGCUAUGUGAGAUUAAUAAAU-3′ (Sangon Biotech) foi usado como o fio primer e um oligonucleotídeo de RNA mais longo com uma sequência de 5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUAAUCUCAUAUAUAUAUC-3′ (Sangon Biotech) foi usado como fio de modelo. Para ressar o duplex RNA, ambos os oligonucleotídeos foram misturados em relação molar igual em tampão de renascimento (10mM Tris-HCl, pH8.0, 25mM NaCl e 2,5mM EDTA), desnaturados pelo aquecimento para 94 °C por 5min e, em seguida, lentamente resfriados à temperatura ambiente. O modelo poly-U-primer RNA foi preparado semelhante ao poli-A com as sequências de 5'-FAM-GCUAUGUGAGAUUAUAU-3′ e 5'-UUUUUUUUUUAUAUAUAUAAUCUCAUAUAGC-3′. Ensaio de mudança de mobilidade de gel para detectar ligação de proteína RNA-RdRp. Um ensaio de mudança de mobilidade de gel foi realizado para detectar o efeito de compostos testados na ligação RNA pelo complexo RdRp. A reação de ligação continha 20mM Tris-HCl 8.0, 10mM KCl, 6mM MgCl2, 0,01% Triton-X100, 1mM DTT, 1.14Uμl −1 Inibidor de RNase (Vazyme Biotech), 9μg de proteína complexa RdRp com 1μg de modelo poli-A: primer RNA e quantidades crescentes de compostos correspondentes (0, 1, 10, 100, 1.000 e 5.000μM para suramin, e 0, 1, 10, 100, 1000, 5.000 e 10.000μM para RDV-TP). As reações de ligação foram incubadas por 30min à temperatura ambiente e resolvidas em gel de poliacrilamida nativo de 4-20% (Thermo Fisher) em 1× tampão TBE a 90V por 1,5h em uma sala fria de 4 °C. O gel foi imageado com um Tanon-5200 Multi Fluorescence Imager de acordo com o protocolo do fabricante. Ensaio de atividade enzimática rdRp e sua inibição por suramina. O complexo purificado SARS-CoV-2 RdRp da célula de insetos na concentração final de 1μM foi incubado com 3.0μM poly-A template-primer RNA e 10mM UTP(Macklin) na presença de 1.14Uμl −1 Inibidor de RNase em tampão de reação contendo 20mM Tris, pH8.0, 10mM KCl, 6mM MgCl2, 0,01% Triton-X100 e 1mM DTT, que foram preparados com água tratada com DEPC. O volume total de reação foi de 20μl. Após a incubação por 60min em um banho de água de 37°C, 40μl de tampão de sada (94% de formamide, 30mM EDTA, prepare-se com água tratada com DEPC) foi adicionado para parar a reação. Uma amostra de 18μl de reação foi misturado com 2μl de 10× tampão de carregamento de DNA (Solarbio). Metade da amostra (10μl) foi carregado em um gel desnaturado de 10% de ureia-PAGE, executado a 120V por 1h, e imageado com um Tanon-5200 Multi Fluorescence Imager. A configuração para os ensaios de inibição do RdRp por suramina é idêntica à acima para os ensaios enzimáticos RdRp, exceto que a suramina foi adicionada às concentrações finais de 0, 1, 2, 4, 8, 16 e 32μM por 60min antes da adição de UTP de 10mM. Ensaio de atividade baseado em fluorescência para SARS-CoV-2 RdRp. A detecção da síntese de RNA por SARS-CoV-2 RdRp foi estabelecida com base em um ensaio em tempo real com o corante fluorescente SYTO 9 (Thermo Fisher), que liga moléculas de modelo de RNA de dois fios, mas não de fio único. A fluorescência emitida foi registrada em tempo real utilizando um TECAN F200 com filtros de excitação e emissão a 485 e 520nm, respectivamente. O ensaio registra a síntese de dsRNA em uma reação usando uma molécula de poli-U como modelo e ATP como substrato nucleotídeo, que foi adaptado a partir de métodos previamente documentados para a detecção da atividade de polimerase do vírus Zika34. As reações foram realizadas em poços individuais de placas inferiores redondas de 384 bem baixos. A reação padrão continha 20mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM KCl, 6mM MgCl2, 180μM ATP, 0.2μM poly-U modelo-primer RNA, 0,01%Trition-X100,1mM DTT,0.025Uml−1 RNase Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos inibidores (Vazyme Biotech) e 0,25μM SYTO 9 (50μSolução de estoque M em pH7.5 tampão de TE). O ensaio foi iniciado pela adição de 5μGML-1 SARS-CoV-2 RdRp e a fluorescência foram registradas acima de 30min em temperatura ambiente. A reação com equivalente a dimetilsulfoxida (DMSO) foi definida como um controle máximo, enquanto a reação sem SARS-CoV-2 RdRp foi definida como um controle mínimo. As reações foram realizadas na presença de 0,2μModelo M poly-U: primer RNA e 180μm ATP, e concentrações crescentes de cada inibidor. Os resultados fluorométricos foram expressos como médias±s.d. A significância estatística foi analisada por análise bidirecional de variância (ANOVA) utilizando GraphPad Prism, v.8, conforme especificado nas legendas-figuras. As determinações do km foram obtidas plotando a velocidade da reação em função de concentrações de modelo nucleotídeo ou ssRNA utilizando regressão não linear. Os valores ic50 foram obtidos mediante a montagem dos dados de velocidade em uma equação logística de quatro parâmetros. Parâmetros cinéticos e valores IC50 foram calculados utilizando-se Sigmaplot v.11. Ensaio antiviral baseado em células Vero E6 para derivados de suramina e suramina. A linha celular Vero E6 foi obtida da American Type Culture Collection (nº 1586) e mantida no Medium Águia Modificada de Dulbecco (Gibco Invitrogen) suplementada com 10% de soro bovino fetal (Gibco Invitrogen), 1% antibiótico/antimírico (Gibco Invitrogen), a 37 °C em uma incubadora de CO2 umidóide 5% Um isolado clínico do SARS-CoV-2 (nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/ WIV04/2019) foi propagado em células Vero E6 que foram testadas livres de contaminação por micoplasma, e o título viral foi determinado por 50% da dose infecciosa da cultura tecidual usando imunofluorescência como teste16. Todos os experimentos de infecção foram realizados no nível 3 de biossegurança (BSL-3). As células Vero E6 pré-semeadas (5×104 células por poço) foram incubadas com as diferentes concentrações dos compostos indicados por 1h, e depois foram infectadas com SARS-CoV-2 em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Duas horas depois, a mistura vírus-droga foi removida e as células foram ainda mais cultivadas com um composto fresco contendo meio. Às 24h após a infecção, medimos o número de cópia do RNA viral no supernante celular usando PCR16 em tempo real. Resumidamente, o RNA viral foi extraído da supernasceção da cultura celular usando o MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit (Takara, catálogo nº 9766) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 3μL RNA total foi digerido com borracha de DNA genômico para remover DNA contaminado. Em um 20μl sistema de reação, o DNA complementar de primeira cadeia foi sintetizado, a partir do qual 2μl de cDNA foi usado como modelo para o próximo passo do PCR quantitativo. Os primers utilizados para PCR quantitativo foram RBD-qF1: 5'-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3′ e RBD-qR1: 5′-CTCAAGTGTGTGGATCACG-3′. A amplificação pcr foi realizada da seguinte forma: 95 °C para 5min seguido por 40 ciclos compostos por 95 °C para 15 s, 54 °C para 15 s e 72 °C para 30 s. DMSO foi utilizado nos controles. Pelo menos dois experimentos independentes foram realizados para cada composto. O ensaio de citotoxicidade. A citotoxicidade das drogas testadas no Vero E6 foi determinada pelos ensaios CCK8 (Beyotime). análise estatística. Os valores ic50 foram expressos como ±s.d. médios a partir de dois experimentos independentes. Os valores EC50 foram expressos como ±s.d. médios a partir de três experimentos independentes. Todos os valores foram determinados através da análise de regressão não linear usando o software GraphPad Prism v.8.0 (Software GraphPad). Resumo de relatórios. Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo de Relatórios de Pesquisa da Natureza vinculado a este artigo. Disponibilidade de dados Mapas de densidade EM e os modelos atômicos foram depositados no EMDB e PDB, respectivamente, com os códigos de adesão EMD-30572 e PDB 7D4F. Os dados de origem são fornecidos com este artigo. Referências 24. Zheng, S. Q. et al. 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Reconhecimentos Os dados crio-EM foram coletados no Centro de Pesquisa de Microscopia Crio-Elétron, Instituto de Materia Medica de Xangai. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Programa Nacional de P&D da China (grant nº 2020YFC0861000), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences grant no. 2020-I2M-CoV19-001 e Tsinghua University-Peking University Center for Life Sciences grant no. 045-160321001 to S.Z.; os Programas Nacionais de P&D da China concedem o nº 2018YFA0507002; O Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai concede o nº 2019SHZDZX02 e o Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências XDB37030103 a H.E.X.; o prêmio CAS Young Innovator Association para W.Y.; o Programa de 100 Talentos da Academia Chinesa de Ciências, Academia Chinesa de Ciências (bolsa não. XDA12010317), Fundação de Ciências Naturais de Xangai (bolsa nº 18ZR1447700) a X.Y.; a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (bolsa nº 31900869) e o Programa de Vela de Xangai (bolsa nº 19YF1456800) à Z.L.; Comissão de Ciência e Tecnologia da Câmara Municipal de Xangai concede a lei nº 20431900100 e a Fundação Jack Ma no 2020-CMKYGG-05 a H.J.; A Fundação Nacional de Ciência Natural concede o nº 31770796, o Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia no. 2018ZX09711002, e K.C. Wong Education Foundation to Y.J., a National Natural Science Foundation of China (grant no. 31970165) para L.Z. e pela National Natural Science Foundation of China (bolsa nº 81903433) às contribuições do autor J.S. W.Y. projetaram a expressão construs construs , purificado o complexo RdRp, preparou amostras e grades crio-EM, realizou coleta e processamento de dados para a determinação da estrutura, analisou as estruturas e preparou figuras e manuscritos. X.L. projetou ensaios de atividade rdrp e descobriu a inibição de RdRp por suramina, participou da interpretação de dados e preparação de figuras. Z.L., Z.Z., Q.W. e X.Y. avaliaram o espécime por EM de mancha negativa, examinaram as condições crio-EM, prepararam as grades crio-EM e coletaram imagens crio-EM e realizaram processamento de dados, cálculos de mapas de densidade, construção de modelos e preparação de figuras. L.Z., Q.W. e G.X. projetaram e realizaram ensaios de inibição viral baseados em células. X.W., F.Z. e M.G. participaram da expressão, purificação e ensaios funcionais dos RdRp. J.S., E.Y. e M.L. participaram da análise de derivados de suramina. Y.J. participou de design experimental e edição de manuscritos. H.J. concebeu e coordenou o projeto. S.Z. concebeu o projeto, iniciou a colaboração com H.E.X. e supervisionou x.L. H.E.X. concebeu e supervisionou o projeto, analisou as estruturas e escreveu o manuscrito com contribuições de todos os autores. Interesses concorrentes Os autores não declaram interesses concorrentes. Informações adicionais Dados estendidos estão disponíveis para este artigo em https://doi.org/10.1038/s41594-021-00570-0. Informações complementares A versão online contém material suplementar disponível em https://doi.org/10.1038/s41594-021-00570-0. A correspondência e os pedidos de materiais devem ser endereçados a L.Z., X.Y., S.Z. ou H.E.X. Informações de revisão por pares Nature Estrutural and Molecular Biology agradece aos revisores anônimos por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho. Relatórios de revisores por pares estão disponíveis. Anke Sparmann foi o principal editor deste artigo e gerenciou seu processo editorial e revisão por pares em colaboração com o resto da equipe editorial. As informações sobre reimpressões e permissões estão disponíveis em www.nature.com/reprints. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Artigos Nature Structural & Molecular Biology Extended Data Fig. 1 | Veja a próxima página para legenda. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos Extended Data Fig. 1 | Purificação e caracterização do complexo RdRp. a, perfil de filtragem de gel do complexo RdRp com nsp7 e nsp8. b, gel SDS do complexo de RdRp purificado com nsp7 e nsp8. c, Mudança de mobilidade gel do complexo RdRp-RNA e o efeito do RDV-TP. d, IC50 de RDV-TP para o complexo RdRp, determinado por dois experimentos independentes e barras de erro significa s.d. dos dados. e, EC50 de remdesivir para inibição SARS-CoV-2 e CC50 de remdesivir para toxicidade baseada em células, determinada por três experimentos independentes e barras de erro significa s.d. dos dados. f, As estruturas de PPADS e iso-PPADS. g, Alongação de RNA duplex parcial pelo complexo de RdRp purificado e sua inibição por 9 derivados de suramina a concentrações de 0,5-5,0 mM, dependendo da solubilidade de cada composto. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Artigos Nature Structural & Molecular Biology Extended Data Fig. 2 | Veja a próxima página para legenda. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos Extended Data Fig. 2 | Análise crio-EM de partículas únicas do complexo RdRp-suramin. a, micrografo crio-EM representativo do complexo RdRp-suramin. b, Representante 2D médias de classe do complexo RdRp-suramin. c, Fourier shell correlação curvas do mapa crio-EM para o complexo suramin-RdRp. d, Distribuição de ângulo de Euler de partículas usadas na reconstrução final. e, Flowchart de obras crio-EM do complexo suramin-RdRp com mapas coloridos pela resolução local (Å). Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Artigos Nature Structural & Molecular Biology Extended Data Fig. 3 | Veja a próxima página para legenda. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos Extended Data Fig. 3 | Mapa Crio-EM para o RdRp em complexo com suramina. a-g, mapa Cryo-EM e modelo de nsp12 (resíduos 111-116, contorno σ nível: 4σ) (A), nsp8-1 (resíduos 127-132, contorno σ nível: 6σ) (B), nsp12 (resíduos 169-199, contorno σ nível: 6σ) (C), nsp7 (resíduos 26-40, contorno σ nível: 6σ) (D), nsp8-2 (resíduos 85-95, contorno σ nível: 5σ) (E), e as duas moléculas de suramina amarradas (F e G, suramin#1, contorno σ nível: 5,5σ; suramin#2, contorno σ nível: 3,5σ). Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Artigos Nature Structural & Molecular Biology Extended Data Fig. 4 | Veja a próxima página para legenda. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos Extended Data Fig. 4 | Comparações estruturais da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin com a estrutura apo-RdRp e outras estruturas do complexo de replicação/transcrição (RTC). As visões gerais da estrutura RdRp-suramin sobrepuseram-se à estrutura apo RdRp (PDB ID: 7BV1) no painel a; a estrutura nsp132-RTC (PDB ID: 6XEZ) no painel b; a estrutura da tampa (-1)'-RTC (PDB ID: 7CYQ) no painel c; e a estrutura de 1 mini RTC (PDB ID: 7CXM) no painel d. Para clareza, apenas os domínios de polimerase são mostrados. Os domínios do polegar, palma e dedos do RdRp da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin estão em azul, laranja e vermelho, respectivamente, com as duas moléculas de suramina em verde. As outras estruturas complexas de RdRp estão em cinza claro. Nature Structural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Artigos Nature Structural & Molecular Biology Extended Data Fig. 5 | Comparação do complexo SARS-CoV-2 RdRp-suramin com o complexo MNV (Murine Noroviruses) complexo RdRp-suramin e MNV RdRp-NF023. a, Superimposição da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin com a estrutura MNV RdRp-suramin (PDB ID: 3UR0) com base no domínio de polimerase. Apenas o domínio de polimerase do RDRp SARS-CoV-2 é mostrado. RdRp na estrutura MNV RdRp-suramin está em cinza claro com as duas moléculas de suramina em amarelo. Os domínios do polegar, palma e dedos no RdRp da estrutura RDRp-suramin SARS-CoV-2 estão em azul, laranja e vermelho, respectivamente, com as duas moléculas de suramina em verde. b, Superposição da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin com estrutura MNV RdRp-NF023 (PDB ID: 3URF) com base no domínio polimerase. A estrutura RdRp em MNV RdRp-NF023 está em cinza claro com a molécula NF023 em magenta. Os domínios do polegar, palma e dedos no RdRp da estrutura RDRp-suramin SARS-CoV-2 estão em azul, laranja e vermelho, respectivamente, com as duas moléculas de suramina em verde. c, Uma visão atenta da suramina dentro do local catalítico na estrutura MNV RdRp-suramin, código de cor como no painel a. d, Uma visão atenta da suramina dentro do local catalótico na estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin, código de cor como nos painéis a e b. e, Uma visão atenta do NF023 dentro do local catallítico na estrutura MNV RdRp-NF023, código de cor como no painel b. Nature Estrutural & Molecular Biology | www.nature.com/nsmb Nature Structural & Molecular Biology Artigos Extended Data Fig. 6 | Comparação do complexo SARS-CoV-2 RdRp-suramin com o complexo de derivados MNV RdRp-suramin 6 e derivado HNV (Human Noroviruses) RdRp-suramin 6. a, Superposição da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin com estrutura derivada MNV RdRp-suramin 6 (PDB ID: 4NUR) com base no domínio de polimerase. Apenas o domínio de polimerase do RDRp SARS-CoV-2 é mostrado. O RdRp na estrutura MNV RdRp-6 é em cinza claro com a molécula derivada de suramina 6 em azul claro. Os domínios do polegar, palma e dedos no RdRp da estrutura RDRp-suramin SARS-CoV-2 estão em azul, laranja e vermelho, respectivamente, com as duas moléculas de suramina em verde. b, Superposição da estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin com estrutura derivada 6 HNV RdRp-suramin (PDB ID: 4NRT) com base no domínio polimerase. O RdRp na estrutura HNV RdRp-6 é em cinza claro com derivado de suramina 6 em ciano. Os domínios do polegar, palma e dedos no RdRp da estrutura RDRp-suramin SARS-CoV-2 estão em azul, laranja e vermelho, respectivamente, com as duas moléculas de suramina em verde. c, Uma visão atenta do derivado de suramina 6 dentro do site ativo na estrutura derivada MNV RdRp-suramin 6, o código de cor é usado como no painel a. d, Uma visão atenta da suramina dentro do local ativo na estrutura SARS-CoV-2 RdRp-suramin, o código de cor é usado como nos painéis a e b. e, Uma visão atenta do derivado de suramina 6 dentro do local ativo na estrutura derivada HNV RdRp-suramin 6, o código de cor é usado como no painel b.

O Laboratório chaves de pesquisa de receptores, Instituto de Xangai médico, Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China. 2 Escola de Medicina, Universidade de Tsinghua, Haidiano Distrito, Pequim, China. 3 Departamento de Cardiologia, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College e Academia Chinesa de Ciências Médicas, Pequim, China. 4Tsinghua-Pequim Center for Life Sciences, Tsinghua University, Pequim, China. 5 Centro de Pesquisa em Microscopia Crio-Elétron, Instituto de Materia de Xangai médico, Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China. 6Universidade da Academia Chinesa de Ciências, Pequim, China. 7 Laboratório De Virologia do Estado, Instituto Wuhan de Virologia, Centro de Megaciência de Biossegurança, Academia Chinesa de Ciências, Wuhan, Hubei, China. 8WuxiBiortus Biosciences Co. Ltd. 9Os autores contribuíram igualmente: Wanchao Yin Xiaodong Luan, Zhihai Li, Rio Ziwei Zhou, Qingxing Wang. ✉e-mail: zhangleike@wh.iov.cn; xkyu@simm.ac.cn; shuyangzhang103@nrdrs.org.eric.xu@


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