Tela CRISPR de genoma completo revela maneiras surpreendentes de os neurônios sobreviverem ao estres



A microscopia de super resolução de um neurônio mostra o acúmulo de lipídios dentro de lisosomos que ocorre quando o gene para prosaposina é suprimido.


A tecnologia de edição de genes CRISPR permitiu aos pesquisadores identificar neurônios e mecanismos específicos relacionados aos efeitos do estresse oxidativo no cérebro.

Quando um único gene em uma célula é ligado ou desligado, sua presença ou ausência resultante pode afetar a função e a sobrevivência da célula.

Em um novo estudo que aparece em 24 de maio na Nature Neuroscience,pesquisadores da UCSF catalogaram com sucesso esse efeito no neurônio humano, toggling separadamente cada um dos 20.000 genes no genoma humano.

Ao fazê-lo, eles criaram uma técnica que pode ser empregada para muitos tipos diferentes de células, bem como um banco de dados onde outros pesquisadores que usam a nova técnica podem contribuir com conhecimento semelhante, criando uma imagem da função genética em doenças em todo o espectro das células humanas.

"Este é o próximo passo fundamental para descobrir os mecanismos por trás dos genes da doença", disse Martin Kampmann, PhD, professor associado do Instituto de Doenças Neurodegenerativas e do Instituto weill de neurociências da UCSF, observando que o trabalho aproveita os recentes avanços no sequenciamento genético, tecnologia de células-tronco e CRISPR.

"Há muitos estudos de genética humana ligando genes específicos a doenças específicas", disse Kampmann. "O trabalho que estamos fazendo pode fornecer uma visão de como as mudanças nesses genes levam à doença e nos permitem direcioná-los com tratamentos."

Sua equipe estava interessada em identificar genes que poderiam estar envolvidos em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e formas relacionadas de demência. Sua abordagem incluiu o uso de neurônios humanos gerados por células-tronco e a identificação de alterações químicas que ocorrem na célula quando os genes individuais são ligados e desligados.

Eles estavam procurando especificamente por mudanças a jusante na expressão genética que produziriam estresse oxidativo na célula, uma circunstância em que formas altamente reativas de oxigênio podem criar um ambiente tóxico. Acredita-se que tais condições contribuam para a neurodegeneração.

A inversão de interruptores genéticos revela resultados inesperados

Para examinar genes individuais e aprender mais sobre suas funções, Kampmann empregou uma técnica chamada ativação/interferência crispr, ou CRISPR a/i, que ele co-desenvolveu como um estudioso de pós-doutorado da UCSF trabalhando em células cancerosas com Jonathan Weissman, PhD, um ex-membro do corpo docente da UCSF e atual membro do Instituto Whitehead e pesquisador do Howard Hughes Medical Institute. O CRISPR a/i permite que um pesquisador desligue ou ligue temporariamente um único gene e veja como essa mudança afeta a expressão de outros genes.

Usando esta ferramenta no neurônio humano, Kampmann ligou e desligou um gene após o outro, usando um corante para visualizar a presença de oxigênio altamente reativo. Entre os achados mais interessantes foi que desligar o gene para uma proteína chamada prosaposina, que normalmente auxilia na reciclagem de resíduos da célula, aumentou consideravelmente os níveis de estresse oxidativo.

Nos neurônios, a prosaposina está associada a uma parte da célula chamada lysosome, onde moléculas biológicas e toxinas são classificadas e tratadas de várias maneiras. "À primeira vista, prosaposin não deve ter nada a ver com moléculas oxidativas. Chamou nossa atenção porque esse gene tinha sido recentemente ligado à doença de Parkinson", disse Kampmann. "O que foi realmente emocionante foi que agora, com os resultados desta tela CRISPR, tínhamos um modelo baseado em células para nos ajudar a entender o que está por trás dessa ligação."

A equipe então embarcou no que Kampmann chamou de "história de detetive" para descobrir como a falta de prosaposina está ligada à neurodegeneração. Os pesquisadores descobriram que a supressão do gene levou ao acúmulo de uma substância chamada pigmento de idade, que tem sido vista em células envelhecidas cujos licomentos não degradam mais o material de forma tão eficiente. Os pesquisadores descobriram que o pigmento da idade aprisionou o ferro, gerando moléculas reativas de oxigênio que desencadearam a ferroptose, um processo dependente do ferro que leva à morte celular.

"Simplesmente inativando um único gene", disse Kampmann, "em poucos dias poderíamos gerar uma marca de envelhecimento que normalmente levaria décadas para se desenvolver no corpo humano".

Construindo um banco de dados global de função genética

A tela genética de Kampmann é a primeira do tipo realizada em neurônios humanos.

A cascata de mudanças observadas por ele é específica para a função dos neurônios e está relacionada a apenas um conjunto de condições. Ele disse que os resultados são um caso para o uso do CRISPR a/i para realizar telas semelhantes em busca de mudanças que provoquem outros tipos de ambientes relacionados à doença em neurônios e outros tipos de células diferenciadas.

Para isso, Kampmann criou um banco de dados de acesso aberto chamado CRISPRbrain, onde ele e outros cientistas podem compartilhar e estudar conjuntos de dados em larga escala como os gerados por suas telas genéticas. A aplicação de tecnologia computacional avançada, como o aprendizado de máquina, pode então detectar padrões neste mar de dados.

"Ao nos tornarmos os dados comuns para telas de muitos tipos de células diferentes de muitos laboratórios diferentes e em diferentes contextos de doenças, podemos alcançar uma massa crítica de informações", disse ele. "Há um enorme poder em agregar e cruzar tudo isso."

O próximo passo da equipe é realizar telas semelhantes em neurônios feitos a partir de células-tronco derivadas de pacientes com mutações conhecidas por contribuir para a neurodegeneração, bem como olhar para outras células, como astrócitos e microglia que desempenham papéis em doenças cerebrais.

A esperança de Kampmann é que a tecnologia e o banco de dados sejam amplamente adotados. "Agora que podemos fazer isso de forma sistemática, podemos realmente interpretar os processos subjacentes de como os genes contribuem para a doença e encontrar caminhos para tratar essas condições."

“Genome-wide CRISPRi/a screens in human neurons link lysosomal failure to ferroptosis” by Ruilin Tian, Anthony Abarientos, Jason Hong, Sayed Hadi Hashemi, Rui Yan, Nina Dräger, Kun Leng, Mike A. Nalls, Andrew B. Singleton, Ke Xu, Faraz Faghri & Martin Kampmann. Nature Neuroscience

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