Pior que a doença? Revendo algumas possíveis consequências das vacinas mRNA contra C19




Stephanie Seneff1 e Greg Nigh2

1 Laboratório de Ciência e Inteligência Artificial, MIT, Cambridge MA, 02139, EUA, E-mail:

seneff@csail.mit.edu

2 Oncologia , Saúde de Imersão, Portland, OU 97214, EUA

International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research 2(1), May 10, 2021


A Operação Warp Speed trouxe ao mercado nos Estados Unidos duas vacinas mRNA, produzidas pela Pfizer e Pela Moderna. Dados provisórios sugeriram alta eficácia para ambas as vacinas, o que ajudou a legitimar a Autorização de Uso de Emergência (EUA) pela FDA. No entanto, o movimento excepcionalmente rápido dessas vacinas através de ensaios controlados e para a implantação em massa levanta múltiplas preocupações de segurança. Nesta revisão, descrevemos pela primeira vez a tecnologia subjacente a essas vacinas em detalhes. Em seguida, revisamos ambos os componentes e a resposta biológica pretendida a essas vacinas, incluindo a produção da própria proteína S, e sua potencial relação com uma ampla gama de patologias induzidas agudas e de longo prazo, como distúrbios sanguíneos, doenças neurodegenerativas e doenças autoimunes. Entre essas patologias induzidas potenciais, discutimos a relevância das sequências de aminoácidos relacionados à proteína de prion dentro da proteína S. Também apresentamos uma breve revisão de estudos que apoiam o potencial de "Shedding de proteína S", transmissão da proteína de uma pessoa vacinada para uma pessoa não vacinada, resultando em sintomas induzidos neste último. Terminamos abordando um ponto de debate comum, ou seja, se essas vacinas poderiam ou não modificar o DNA daqueles que recebem a vacina. Embora não existam estudos que demonstrem definitivamente que isso está acontecendo, fornecemos um cenário plausível, apoiado por caminhos previamente estabelecidos para transformação e transporte de material genético, pelo qual o mRNA injetado poderia, em última análise, ser incorporado ao DNA de células germinativas para transmissão transgeracional.

Concluímos com nossas recomendações relativas à vigilância que ajudarão a esclarecer os efeitos a longo prazo dessas drogas experimentais e nos permitem avaliar melhor a verdadeira relação risco/benefício dessas novas tecnologias.


Palavras-chave: aprimoramento dependente de anticorpos, doenças autoimunes, edição de genes, nanopartículas lipídicas, RNA mensageiro, doenças de príon, transcrição reversa, vacinas SARS-CoV-2


Introdução

inédito. Esta palavra definiu tanto sobre 2020 e a pandemia relacionada ao SARS-CoV-2. Além de uma doença sem precedentes e sua resposta global, o COVID-19 também iniciou um processo sem precedentes de pesquisa, produção, testes e distribuição pública (Shaw,International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research 2(1), 10 de maio de 2021 Página | 38


2021). O senso de urgência em torno do combate ao vírus levou à criação, em março de 2020, da Operação Warp Speed (OWS), programa do então presidente Donald Trump para trazer uma vacina contra o COVID-19 ao mercado o mais rápido possível (Jacobs e Armstrong, 2020).

A OWS estabeleceu alguns aspectos mais sem precedentes do COVID-19. Primeiro, trouxe o Departamento de Defesa dos EUA em colaboração direta com os departamentos de saúde dos EUA no que diz respeito à distribuição de vacinas (Bonsell, 2021). Em segundo lugar, os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) colaboraram com a empresa de biotecnologia Moderna para trazer ao mercado um tipo inédito de vacina contra doenças infecciosas, utilizando uma tecnologia baseada no RNA mensageiro (mRNA) (National Institutes of Health, 2020).

A confluência desses eventos sem precedentes trouxe rapidamente à conscientização pública a promessa e o potencial das vacinas mRNA como uma nova arma contra doenças infecciosas no futuro. Ao mesmo tempo, eventos sem precedentes são, por definição, sem histórico e contexto contra os quais avaliar plenamente os riscos, a expectativa de benefícios, a segurança e a viabilidade a longo prazo como contribuição positiva para a saúde pública.

Neste artigo, revisaremos brevemente um aspecto particular desses eventos sem precedentes, a formação e implantação de vacinas mRNA contra a classe alvo de doenças infecciosas sob o guarda-chuva de "SARS-CoV-2". Acreditamos que muitas das questões que levantamos aqui serão aplicáveis a qualquer vacina mRNA futura que possa ser produzida contra outros agentes infecciosos, ou em aplicações relacionadas ao câncer e doenças genéticas, enquanto outras parecem especificamente relevantes para as vacinas mRNA atualmente sendo implementadas contra a subclasse de vírus corona. Embora as promessas desta tecnologia tenham sido amplamente anunciadas, os riscos e preocupações objetivamente avaliados têm recebido uma atenção muito menos detalhada. Nossa intenção é rever vários aspectos moleculares altamente preocupantes da tecnologia de mRNA relacionada a doenças infecciosas, e correlacioná-los com efeitos patológicos documentados e potenciais.

Desenvolvimento de Vacinas

Desenvolvimento de vacinas mRNA contra doenças infecciosas são sem precedentes em muitos aspectos.

Em uma publicação de 2018 patrocinada pelo Projeto de Lei e Fundação Melinda Gates, as vacinas foram divididas em três categorias: Simples, Complexo e Inédito (Young et al., 2018). As vacinas simples e complexas representavam aplicações padrão e modificadas das tecnologias vacinais existentes. Sem precedentes representa uma categoria de inédito

Muitos aspectos do Covid-19 e subsequente desenvolvimento de vacinas são inéditos para uma vacina implantada para uso na população em geral. Algumas delas incluem o seguinte.

1. Primeiro a usar PEG (polietileno glicol) em uma injeção (ver texto)

2. Primeiro a usar a tecnologia de vacina mRNA contra um agente infeccioso

3. Primeira vez que a Moderna trouxe qualquer produto ao mercado

4. Primeiro ter funcionários da saúde pública dizendo aos que recebem a vacina para esperar uma reação adversa

5. Primeiro a ser implementado publicamente com nada mais do que dados preliminares de eficácia (ver texto)

6. Primeira vacina a não fazer afirmações claras sobre a redução de infecções, transmissibilidade ou mortes

7. Primeira vacina contra coronavírus já tentada em humanos

8. Primeira injeção de polinucleotídeos geneticamente modificados na população geral

International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research 2(1), 10 de maio de 2021 Página | 39


vacina contra uma doença para a qual nunca houve uma vacina adequada. Vacinas contra HIV e malária são exemplos. Como sua análise indica, retratada na Figura 1, espera-se que as vacinas sem precedentes levem 12,5 anos para serem desenvolvidas. Ainda mais sinistro, eles têm uma chance estimada de 5% de passar por ensaios da Fase II (avaliando a eficácia) e, desses 5%, uma chance de 40% de passar por ensaios da Fase III (avaliando o benefício populacional). Em outras palavras, previu-se que uma vacina sem precedentes teria uma probabilidade de sucesso de 2% na fase de um ensaio clínico da Fase III. Como os autores disseram sem rodeios, há uma "baixa probabilidade de sucesso, especialmente para vacinas sem precedentes". (Young et al., 2018)

Figura 1. O lançamento de vacinas inovadoras é caro e demorado, com baixa probabilidade de sucesso, especialmente para vacinas sem precedentes (adaptadas de Young et al, 2018).

Com isso em mente, dois anos depois temos uma vacina sem precedentes com relatos de 90-95% de eficácia (Baden et al. 2020). De fato, esses relatos de eficácia são a principal motivação por trás do apoio público à adoção da vacinação (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, 2020). Isso desafia não só as previsões, mas também as expectativas. O British Medical Journal (BMJ) pode ser a única publicação médica convencional proeminente que deu uma plataforma para vozes chamando a atenção para preocupações em torno da eficácia das vacinas COVID-19. Há, de fato, razões para acreditar que as estimativas de eficácia precisam de reavaliação.

Peter Doshi, editor associado do BMJ, publicou duas análises importantes (Doshi 2021a, 2021b) dos dados brutos divulgados à FDA pelos fabricantes de vacinas, dados que são a base para a alegação de alta eficácia. Infelizmente, estes foram publicados no blog do BMJ e não em seu conteúdo revisado por pares. Doshi, porém, publicou um estudo sobre a eficácia da vacina e a utilidade questionável dos pontos finais do teste de vacinas no conteúdo revisado por pares do BMJ (Doshi 2020).

Um aspecto central da crítica de Doshi aos dados preliminares de eficácia é a exclusão de mais de 3.400 "casos suspeitos de COVID-19" que não foram incluídos na análise provisória dos dados da vacina Pfizer submetidos à FDA. Além disso, um percentual baixo, mas não trivial de indivíduos em ambos modernos e os ensaios da Pfizer foram considerados SARS-CoV-1 positivos na linha de base, apesar da infecção anterior ser motivo para exclusão. Por essas e outras razões, a estimativa de eficácia provisória de cerca de 95% para ambas as vacinas é suspeita.

Uma análise mais recente analisou especificamente a questão da redução relativa versus absoluta do risco. Embora as altas estimativas de redução de risco sejam baseadas em riscos relativos, a redução absoluta do risco é uma métrica mais adequada para um membro do público em geral determinar se uma vacinação fornece uma redução significativa do risco pessoalmente. Nessa análise, utilizando dados fornecidos pelos fabricantes de vacinas ao FDA, a vacina Moderna no momento da análise provisória demonstrou uma redução absoluta do risco de 1,1% (p= 0,004), enquanto a redução absoluta do risco da vacina Pfizer foi de 0,7% (p<0.000) (Brown 2021).

Outros trouxeram à tona questões adicionais importantes sobre o desenvolvimento da vacina COVID-19, questões com relevância direta para as vacinas mRNA aqui revisadas. Por exemplo, Haidere, et. al. (2021) identificar quatro "questões críticas" relacionadas ao desenvolvimento dessas vacinas, questões que são sobre sua segurança e sua eficácia:

• As vacinas estimularão a resposta imune?

• As vacinas fornecerão resistência imune sustentável?

• Como o SARS-CoV-2 sofrerá mutação?

• Estamos preparados para a vacina Sair pela culatra?

A falta de ensaios pré-clínicos e clínicos padrão e prolongado das duas vacinas mRNA implementadas deixa cada uma dessas perguntas a ser respondida ao longo do tempo. Somente agora, apenas através da observação de dados fisiológicos e epidemiológicos pertinentes gerados pela entrega em larga escala das vacinas ao público em geral, essas questões serão resolvidas. E isso só é possível se houver livre acesso a relatórios imparciais de resultados - algo que parece improvável dada a censura generalizada de informações relacionadas a vacinas devido à necessidade percebida de declarar sucesso a todo custo.

As duas vacinas mRNA que passaram por testes de fase 3 e agora estão sendo entregues à população em geral são a vacina Moderna e a vacina Pfizer-BioNTech. As vacinas têm muito em comum. Ambos são baseados em mRNA codificando a proteína S do vírus SARS-CoV-2. Ambos demonstraram uma taxa de eficácia relativa de 94-95%. As indicações preliminares são de que os anticorpos ainda estão presentes após três meses. Ambos recomendam duas doses espaçadas por três ou quatro semanas, e recentemente há relatos de injeções anuais de reforço sendo necessárias (Mahose, 2021). Ambos são fornecidos através de injeção muscular, e ambos requerem armazenamento de congelamento profundo para evitar que o RNA se quebre. Isso porque, ao contrário do DNA de dois fios, que é muito estável, os produtos de RNA de fio único são capazes de serem danificados ou tornados impotentes a temperaturas quentes e devem ser mantidos extremamente frios para manter sua eficácia potencial (Pushparajah et al., 2021). Alega-se pelos fabricantes que a vacina Pfizer requer armazenamento a -94 graus Fahrenheit (-70 graus Celsius), o que torna muito desafiador transportá-la e mantê-la fria durante o interinseto antes de ser finalmente administrada. A vacina Moderna pode ser armazenada por 6 meses a -4 graus Fahrenheit (- 20 graus Celsius), e pode ser armazenada com segurança na geladeira por 30 dias após o descongelamento (Zimmer et al., 2021).


Duas outras vacinas que agora estão sendo administradas sob uso emergencial são a vacina Johnson & Johnson e a vacina AstraZeneca. Ambos são baseados em uma tecnologia de DNA vetorial que é muito diferente da tecnologia usada nas vacinas mRNA. Embora essas vacinas também tenham sido levadas ao mercado com avaliação insuficiente, elas não são o tema deste artigo, por isso vamos apenas descrever brevemente como elas são desenvolvidas. Essas vacinas são baseadas em uma versão defeituosa de um adenovírus, um vírus de DNA de dupla cadeia que causa o resfriado comum. O adenovírus foi geneticamente modificado de duas maneiras, de modo que não pode se replicar devido a genes críticos ausentes, e seu genoma foi aumentado com o código de DNA para a proteína de pico SARS-CoV-2. A produção de AstraZeneca envolve uma linha celular humana imortalizada chamada Rim Embrionário Humano (HEK) 293, que é cultivada na cultura junto com os vírus defeituosos (Dicks et al., 2012). A linha celular HEK foi geneticamente modificada na década de 1970, aumentando seu DNA com segmentos de um adenovírus que fornecem os genes perdidos necessários para a replicação do vírus defeituoso (Louis et al., 1997). Johnson & Johnson usa uma técnica semelhante baseada em uma linha de células de retina fetal. Como a fabricação dessas vacinas requer linhas genéticas de células tumorais humanas, há o potencial de contaminação do DNA humano, bem como muitos outros potenciais contaminantes.

A mídia gerou muita excitação sobre essa tecnologia revolucionária, mas também há preocupações de que possamos não estar percebendo a complexidade do potencial do corpo para reações ao mRNA estrangeiro e outros ingredientes nessas vacinas que vão muito além do simples objetivo de enganar o corpo para produzir anticorpos para a proteína S.

No restante deste artigo, primeiro descreveremos com mais detalhes a tecnologia por trás das vacinas mRNA. Dedicamos várias seções a aspectos específicos das vacinas mRNA que nos preocupam com o potencial de consequências negativas previsíveis e imprevisíveis. Concluímos com um apelo aos governos e à indústria farmacêutica para que considerem exercer maior cautela na atual empreitada para vacinar o maior número possível de pessoas contra o SARS-CoV-2.

Tecnologia de vacinas mRNA

Na fase inicial do desenvolvimento da terapia genética baseada em nucleotídeos, houve consideravelmente mais esforço investido na entrega de genes através de plasmídeos de DNA em vez de através da tecnologia mRNA. Dois grandes obstáculos para o mRNA são sua natureza transitória devido à sua suscetibilidade à quebra pela RNAses, bem como seu poder conhecido de invocar uma forte resposta imune, que interfere com sua transcrição em proteína. O DNA plasmídeo tem sido mostrado para persistir em músculos até seis meses, enquanto o mRNA quase certamente desaparece muito mais cedo. Para aplicações de vacinas, pensava-se originalmente que a natureza imunogênica do RNA poderia funcionar a um favor, já que o mRNA poderia dobrar como um adjuvante para a vacina, eliminando os argumentos a favor de um aditivo tóxico como o alumínio. No entanto, a resposta imune resulta não apenas em uma resposta inflamatória, mas também na rápida liberação do RNA e supressão da transcrição. Então essa ideia acabou não sendo prática.

Houve um longo período de tempo sobre o qual várias ideias foram exploradas para tentar evitar que o mRNA se quebrasse antes que pudesse produzir proteínas. Um grande avanço foi a constatação de que substituir a metil-pseudouridina por todos os nucleotídeos uridinas estabilizaria o RNA contra a degradação, permitindo que ele sobrevivesse tempo suficiente para produzir quantidades adequadas de antígeno proteico necessário para a imunogênese (Liu, 2019). Esta forma de mRNA entregue na vacina nunca é vista na natureza e, portanto, tem potencial para consequências desconhecidas.

As vacinas Pfizer-BioNTech e Moderna mRNA são baseadas em tecnologias muito semelhantes, onde uma nanopartícula lipídica inclui uma codificação de sequência de RNA para a proteína S SARS-CoV-2 de comprimento completo. No processo de fabricação, o primeiro passo é montar uma molécula de DNA codificando a proteína do pico. Este processo foi agora comoditizado, por isso é relativamente simples obter uma molécula de DNA a partir de uma especificação da sequência de nucleotídeos (Corbett et al., 2020). Após uma transcrição in vitro livre de células do DNA, utilizando uma reação enzimática catalisada pela polimerase de RNA, o RNA de uma única cadeia é estabilizado através de modificações de nucleosídeos específicos, e altamente purificado.

A empresa Moderna, em Cambridge, MA, é uma das desenvolvedoras de vacinas mRNA implantadas para SARS-CoV-2. Os executivos da Moderna têm uma grande visão de ampliar a tecnologia para muitas aplicações onde o corpo pode ser direcionado para produzir proteínas terapêuticas não apenas para a produção de anticorpos, mas também para tratar doenças genéticas e câncer, entre outras. Eles estão desenvolvendo uma plataforma genérica onde o DNA é o elemento de armazenamento, o RNA mensageiro é o "software" e as proteínas que os códigos RNA representam diversos domínios de aplicativos. A visão é grandiosa e as aplicações de potencial teórico são vastas (Moderna, 2020). A tecnologia é impressionante, mas a manipulação do código de vida pode levar a efeitos negativos completamente imprevistos, potencialmente a longo prazo ou até mesmo permanentes.

SARS-CoV-2 é um membro da classe de vírus RNA de fios positivos, o que significa que eles codificam diretamente para as proteínas que o RNA codifica, em vez de exigir uma cópia para uma cadeia antissense antes da tradução em proteína. O vírus consiste principalmente da molécula de RNA de uma única linha embalada dentro de uma camada de proteína, consistindo das proteínas estruturais do vírus, mais notavelmente a proteína S, que facilita tanto a ligação viral a um receptor (no caso do SARS-CoV-2 este é o receptor ACE2) e fusão de vírus com a membrana celular hospedeira. A proteína de pico SARS-CoV-2 é o alvo principal para neutralizar anticorpos. É uma glicoproteína de fusão classe I, e é análoga à haemagglutinina produzida por vírus da gripe e à glicoproteína de fusão produzida por vírus sincicial, bem como gp160 produzido pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Corbett et al., 2020).

As vacinas mRNA são o ápice de anos de pesquisa na exploração da possibilidade de uso de RNA encapsulado em uma partícula lipídica como mensageiro. O maquinário biológico existente da célula hospedeira é cooptado para facilitar a produção natural de proteínas do mRNA. O campo floresceu em parte devido à facilidade com que sequências específicas de DNA oligonucleotídeo podem ser sintetizadas em laboratório sem o envolvimento direto de organismos vivos. Essa tecnologia tornou-se commodity e pode ser feita em larga escala, com custo relativamente baixo. A conversão enzimática de DNA para RNA também é simples, e é viável isolar essencialmente o RNA de uma única cadeia pura da sopa de reação (Kosuri e Church, 2014).

1. Considerações na seleção e modificação do mRNA


Embora o processo seja simples, em princípio, os fabricantes de vacinas mRNA enfrentam alguns desafios técnicos consideráveis. A primeira, como discutimos, é que o mRNA extracelular em si pode induzir uma resposta imune que resultaria em sua rápida liberação antes mesmo de ser tomada por Células. Então, o mRNA precisa ser envolto em uma nanopartícula que vai mantê-lo escondido do sistema imunológico. A segunda questão é fazer com que as células tomem as nanopartículas. Isso pode ser resolvido em parte incorporando fosfolipídios na nanopartícula para aproveitar as vias naturais da endocitose de partículas lipídicas. O terceiro problema é ativar o maquinário que está envolvido na tradução do RNA em proteína. No caso do SARS-CoV-2, a proteína produzida é a proteína S. Após a síntese de proteínas S, as células que apresentam antígenos precisam apresentar a proteína S às células T, que em última análise produzirão anticorpos de memória protetora (Moderno, 2020). Este passo não é particularmente simples, porque as nanopartículas são tomadas principalmente por células musculares, que, estando imóveis, não estão necessariamente equipadas para lançar uma resposta imune. Como veremos, o cenário provável é que a proteína do pico é sintetizada por células musculares e, em seguida, entregue aos macrófagos agindo como células que apresentam antígeno, que então lançam a resposta padrão de cascata baseada em anticorpos baseados em células B.

O mRNA que está incluído nas vacinas passa por várias etapas de modificação após sua síntese a partir de um modelo de DNA. Algumas dessas etapas envolvem prepará-lo para parecer exatamente como uma sequência de mRNA humana apropriadamente modificada para suportar a tradução ribossômica em proteína. Outras modificações têm o objetivo de protegê-la da quebra, de modo que proteínas suficientes possam ser produzidas para obter uma resposta de anticorpos. O mRNA não modificado induz uma resposta imune que leva a altos níveis de soro de interferon-α (IF- α),o que é considerado uma resposta indesejável. No entanto, pesquisadores descobriram que substituir todas as uridinas no mRNA por N-metil-pseudouridina aumenta a estabilidade da molécula, reduzindo sua imunogenicidade (Karikó et al. 2008; Corbett et al., 2020). Esta etapa faz parte da preparação do mRNA nas vacinas, mas, além disso, uma "tampa" de 7 metilguanosina é adicionada à extremidade de 5' da molécula e uma cauda de poli-adenina (poli-A), composta por 100 ou mais nucleotídeos de adenina, é adicionada ao final de 3'. A tampa e a cauda são essenciais para manter a estabilidade do mRNA dentro do citosol e promover a tradução em proteína (Schlake et al., 2012; Gallie, 1991).

Normalmente, a proteína S muda muito facilmente de uma configuração de pré-fusão para uma configuração pós-fusão. A proteína S que está nessas vacinas foi ajustada para incentivá-la a favorecer uma configuração estável em seu estado de pré-venda, uma vez que este estado provoca uma resposta imune mais forte (Jackson et al., 2020). Isso foi feito por meio de uma "mutação genética", substituindo um segmento crítico de dois resíduos por dois resíduos prolina nas posições 986 e 987, no topo da hélice central da subunidade S2 (Wrapp et al., 2020). Prolina é um aminoácido altamente inflexível, por isso interfere na transição para o estado de fusão. Esta modificação fornece anticorpos muito melhor acesso ao site crítico que suporta fusão e posterior absorção celular. Mas isso também pode significar que a versão geneticamente modificada da proteína S produzida pela célula hospedeira humana seguindo instruções da vacina mRNA permanece na membrana plasmática ligada aos receptores ACE2 por causa de capacidades de fusão prejudicadas? Qual pode ser a consequência disso? Nós não sabemos.

Pesquisadores na China publicaram um relatório na Nature em agosto de 2020 no qual apresentaram dados sobre várias vacinas experimentais de mRNA onde o mRNA codificado para vários fragmentos e proteínas no vírus SARS-CoV-2. Eles testaram três formulações distintas de vacinas para sua capacidade de induzir uma resposta imune apropriada em camundongos. As três proteínas estruturais, S (spike), M e E são requisitos mínimos para montar uma "partícula semelhante a vírus" (VLP). Sua hipótese era que fornecer M e E, bem como a proteína S spike no código mRNA, permitiria a montagem de VLPs que poderiam provocar uma resposta imune melhorada, porque eles se assemelham mais ao vírus natural do que a proteína S exposta na superfície das células que tomaram apenas o mRNA de proteína S das nanopartículas da vacina. Eles também esperavam que fragmentos críticos da proteína S fossem suficientes para induzir imunidade, em vez de toda a proteína S, se partículas semelhantes a virais pudessem ser produzidas através do aumento com M e E (Lu et al., 2020).

Eles confirmaram experimentalmente que uma vacina contendo os genes completos para todas as três proteínas provocou uma resposta imune robusta que durou pelo menos oito semanas após a segunda dose da vacina. Seu desempenho foi muito superior ao de uma vacina contendo apenas a proteína S. Decepcionantemente, uma vacina que continha apenas componentes críticos da proteína S, aumentada com as outras duas proteínas envelope, provocou praticamente nenhuma resposta.

Pesquisadores modernos realizaram estudos semelhantes com resultados semelhantes. Eles concluíram que a proteína S por si só era claramente inferior a uma formulação contendo RNA codificando todas as três proteínas envelope, e eles hipotetizaram que isso foi devido ao fato de que todas as três proteínas eram necessárias para permitir que a célula liberasse partículas intactas semelhantes a vírus, em vez de apenas postar a proteína S na membrana plasmática. A proteína S por si só não conseguiu iniciar uma resposta celular T em estudos em animais, enquanto a formulação com todas as três proteínas fez (Corbett et al., 2020).

As duas vacinas aprovadas por emergência contêm apenas código mRNA para proteína S (sem E ou M), e deve ter havido uma boa razão para essa decisão, apesar de seu fraco desempenho observado. É possível que o design mais sofisticado da nanopartícula lipídica (veja abaixo) resultou na capacidade de fazer com que os lipídios sirvam como um adjuvante (semelhante ao alumínio que é comumente adicionado às vacinas tradicionais) enquanto ainda protege o RNA da degradação.

Outra modificação curiosa no código RNA é que os desenvolvedores enriqueceram a sequência em citosinas e guaninas (Cs e Gs) em detrimento de adeninas e uracilas (As e Us). Eles têm tido o cuidado de substituir apenas a terceira posição no códon desta forma, e somente quando não altera o mapa de aminoácidos (Hubert, 2020). Foi demonstrado experimentalmente que as sequências mRNA ricas em GC são expressas (traduzidas em proteína) até 100 vezes mais eficientes do que as sequências fracas de GC (Kudla et al., 2006). Portanto, esta parece ser outra modificação para garantir ainda mais a síntese de cópias abundantes da proteína S. Não sabemos as consequências não intencionais desta manobra. Patógenos intracelulares, incluindo vírus, tendem a ter baixo teor de GC em comparação com o genoma da célula hospedeira (Rocha e Danchin, 2020). Então, essa modificação pode ter sido motivada em parte pelo desejo de aumentar a eficácia do engano de que a proteína é uma proteína humana.

Todas essas várias modificações no RNA são projetadas para fazê-lo resistir à quebra, parecer mais uma sequência de codificação de proteínas RNA mensageiro humano, e traduzir eficientemente em proteína antigênica.




2. Construção de Nanopartículas Lipídicas


As nanopartículas lipídicas (LNPs), também conhecidas como lipossomos, podem encapsular moléculas de RNA, protegendo-as da degradação enzimática por ribonucleases, e assim formam um ingrediente essencial de um método de entrega bem sucedido (Wadhwa et al., 2020; Xu et al., 2020). Essas construções artificiais se assemelham muito a exosóis. Exosóis são vesículas extracelulares secretados por células e tomados por suas vizinhas, e eles também muitas vezes incorporaram DNA ou RNA. Assim, essas nanopartículas podem aproveitar os processos naturais de endocitose que normalmente internalizam exosóis extracelulares em endossomos. À medida que o endossomo acidifica para se tornar um lisossomo, o mRNA é liberado no citoplasma, e é aí que a tradução para a proteína ocorre. Os lipossomos têm sido mais bem sucedidos no aprimoramento da apresentação de antígenos e na maturação de células dendríticas, quando comparados com proteínas de fusão que encapsulam vacinas baseadas em vírus (Norling et al., 2019).

As nanopartículas lipídicas (LNPs) nessas vacinas são compostas de lipídios ionizáveis, fosfolipídios, colesterol e polietileina glicol (PEG). Juntos, esta mistura se junta em uma bicamadas lipídica estável em torno da molécula de mRNA. Os fosfolipídios nestas vacinas experimentais consistem em um grupo cabeça fosfatidylcolina conectado a duas caudas de alquila saturadas através de um linker glicerol. O lipídio usado nessas vacinas, denominado 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphocholina (DSPC), tem 18 unidades de carbono repetidas. A cadeia relativamente longa tende a formar uma fase de gel em vez de uma fase fluida. Moléculas com cadeias mais curtas (como uma cadeia de 12 carbonos) tendem a permanecer em uma fase fluida. Os lipossomos da fase gel que utilizam o DSPC têm desempenho superior na proteção do RNA da degradação, porque as cadeias de alquil mais longas são muito mais restritas em seus movimentos dentro do domínio lipídico. Eles também parecem ser mais eficientes como adjuvante, aumentando a liberação do fator de necrose tumoral citockinas- α (TNF- α),interleucina (IL)-6 e IL-1